大海捞针的艺术探测微弱信号

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要想研究生物分子等极低浓度的样品，如何萃取微弱的信号是其能谱学的一个根本性的问题。首先，什么是微弱信号呢？直接的答复是：强度很小的信号为微弱信号。这个答案也对也不对。由于现代X–射线探测器均具有几乎单光子的探测能力，仅仅是强度微弱应该还不是问题。真正的问题在于：微弱的信号和强大的背景噪声往往有着相同或相近的起源。如何抑制强大的背景，从而提高信噪比就相当于如何实施大海捞针，是此类能谱学中最重要、最令人关心的问题，同时也是最麻烦的问题。

选择性：大海捞针的关键

让我们先从一个常识性的问题谈起。举例说：如果有一根十分重要的小铁棍不慎落入一个水井中，怎么捞呢？尽管我们已经知道它应该就在井底这么一小片地方，但打捞工作并不十分容易。如果你用绳、钩之类的工具，可能永远也捞不上来，如图1所示。也就是说，打捞方法或打捞工具必须首先具备探测的能力。对于能谱探测来说，也就是要具有探测灵敏度。如前述，现代X–射线探测器的灵敏度一般都很高，不是问题。

图1理解能谱学探测的几个卡通示意图：(a)如果选用不具探测灵敏度的探测器进行探测，就犹如用钩子从井底捞铁棍一样，无法成功；(b)测量弱信号(少数目标)时要有针对性，同重点钓鱼相类似；(c)测量强信号(多数目标)时则可以放宽针对性，一网打尽。

如果人们改用网孔很细的网子来捞，它的确对于人们要捞的物体具有探测灵敏度。乍听起来，好像是很好使的。但是井底除了铁棍之外还有泥巴和水草等各种杂物，这样打捞上来的东西肯定是各物皆有，清理工作十分困难。如果要捞的不是铁棍，而是更小的铁针，那么即便是能捞得上来，恐怕很难清理出来。这就是在微弱信号与强大的背景噪声难以分离的一个形象的例子。

最有效的方法当然是使用强磁铁来捞，这是因为磁铁对铁棍或铁针不仅具有很高的探测灵敏度，而且还具有很强的针对性和选择性，它对其它杂物没有这种探测灵敏度。这样，强磁铁不仅可以捞出铁棍，甚至铁针，而且还大大减少了连带一起捞出的泥土等杂物的数量，成功地抑制了强大的背景噪声，方便了后续的分离工作。再比如：如果渔民想专门捕获某些特殊的、量少的鱼种，一般需要采用具有针对性的钓鱼方法，比如图1(b)。在测量X–射线能谱时，如果信号微弱而背景很强，人们必须选用分辨能力很强、灵敏度又高的探测器和探测方法，在对脉冲信号的甄选上要设法彻底地排除背景噪声，真正做到宁缺勿滥，才有可能收集少量但纯粹的有用信号，获得可用的信噪比。假如有少量噪声混入信号，被同时记录，就会使得信号波动、能谱杂乱，甚至无法辨认其中的某个谱峰是否真实。也就是说，少量的噪声混入真实信号将导致对微弱信号的测量和萃取失败。

总之，微弱信号是指被强大背景埋没的信号，而运用具有针对性和可选择性的探测方法测量来抑制强大背景，萃取微弱信号是大海捞针的关键。

如果要测量的是强度很高的能谱信号，那么即使有少量噪声混入信号，也不会有太大问题。人们此时应该尽可能多和尽可能快地采集信号，尽早完成能谱计数。这好比，如果要捕获鱼群很大，渔民们无需钓鱼，而是可以直接下网，一网打尽[如图1(c)]。

统计性：信号量的重要性

能谱信号的测量为什么需要一定的信号量呢？回顾捞针的问题：由于铁棍太小(信号太弱)，即使使用了具有强选择性的方法，人们可能还是无法保证一次就捞出它。但随着打捞次数的上升，积分效果就一定会获得成功；而每一次被成功打捞的平均概率就会由单一事件时的是(%)与否(0%)的二项分布逐步转化为具有稳定概率的分布，如图2(a)(c)。也就是说：探测事件需要反复进行，统计量越大，结果就越稳定，能谱数据就越可靠。

图2(a、b)正态分布的演变过程；(c)一个正态分布的偏差与出现概率的关系

在统计学原理上，能谱测量犹如图2(a)中的落沙实验：当一粒沙子从一系列竖排格子的正中间上方落下时，它落入那一个个格子是完全随机的，完全不确定的。而一个格子中是否有这粒沙子落入也是完全随机的，如图(a)中的一个粉色的点；当若干粒这样的沙子落下时，大部分的沙子会落入最靠近中间的那个格子，离开中心越远的格子里落入的沙粒越少，但分布仍然有随机性，如图(a)中的条码所示；但当成千上万粒沙子落下时，落沙分布逐渐趋于光滑，呈现有规律的分布，并且左右对称，如图2(b)；如果有无穷多粒沙子落下时，其分布逐渐转化为光滑的正态分布(c)，其分布概率公式为：

式中z为事件的变量，如落沙实验中的格子位置或能谱测量中的能量位置；z0为z分布的中心值，如落沙实验中最中间的格子位置或能谱峰值的能量位置；为z的分布的平均方差值(与线宽成正比)。方差越小，误差越小，分布越集中，线宽越窄；F(z)为事件发生在z点处的概率，比如某个格子中的落沙几率或能谱在某个能量位置上出现事件光子的几率等。

X–射线能谱的计数过程与上面描述的落沙过程极为相似，某个光子是否出现(信号有无)、出现次数(信号振幅)、何时出现、在什么能量位置上出现完全是随机的、不确定的。因此人们无法在仅有很少量计数的测量中获得可靠、稳定、光滑的能谱图。但是经过长时间的大量计数后，这些量都会变得有规律，能谱曲线趋于光滑、稳定。因此，信号量对于谱学的测量也是至关重要的。

增加信号量的方法一般包括：1)增加入射光源强度；2)增加样品的浓度；这两者都是为了增加在单位时间里入射射线与样品相互作用的事件数目；3)增加探测的立体角；4)延长测量时间；后两者是在相互作用事件数目不变的条件下，增加这些事件在探测器上最终获得测量的概率。生物大分子样品的浓度很低，即便是运用今天的第三代同步辐射作为谱学光源，运用最先进的X–射线探头作为谱学探测器，其测量经常是少则需要几小时，多则需要几天，甚至还需要经过多次重复测量，以满足信号总量的要求。

信噪比：鉴定信号的真伪

任何一个能谱测量过程一定是有误差存在的，每一幅能谱图也一定是有噪声的，无法避免。如果信号明显大于噪声，那么我们说信号是可靠的，否则信号可能只是噪声的一部分，不可靠。因此信噪比才是判断能谱图是否可用的最后的准绳。

噪声就是测量的误差，多用方差来表示。对于多次测量的能谱，无论能谱本身是相加或是相减，其统计误差值总是相加的，其绝对量只能是越来越高。但统计误差的累积符合均方根求和规律，而信号的积累符合简单求和规律，即：

我们首先假如被测量的是强信号，其背景计数为零(或其贡献很小，可以忽略)，则噪声和信噪比主要由统计误差本身决定，即：

信号=总计数量(N)，

背景=0

纯信号量=N–0=N

统计误差=N

信号比=N/N=N

也就是说：计数时间越长，计数越高，信噪比越高，能谱测量越可靠。

在有背景信号的一般情况下，实际信号应该是总计数强度(N)与背景计数强度(N0)的差值(N–N0)，而噪声则是总计数量的方根(N)。这样，信噪比就应该等于：

信噪比=(N–N0)/N

因此，信噪比实际上与测量环境和方法有关。比如：假设纯信号量=(N–N0)=0，而背景强度N0等于1,,，此时的信噪比只有0/(1,,)=1，很差；而如果是针对同样的实际信号水平(0)，但背景强度被控制为1，信噪比则提高为0/(1,)31.6，很好。

一个形象的例子是：在远离都市的高山上或沙漠中，我们会很容易地看到满天十分明亮的星星。而在都市中，即便是万里无云，我们也只能看到一些亮度较大的星星。这其中的原因不是由于星星不亮，而是由于都市中灯光的大量漫散射形成了很强的天空背景，从而大大降低了观测星空的信噪比。天文台中长长的望远镜筒子的功能之一就是用来遮蔽背景光线，从而在空间上对信号进行选择、减少背景的。而天文台本身也多建在远离灯光的高山上。

生物大分子中的金属含量甚微，信号比背景要弱得多。要想有效地获取这些微弱的信号，探测系统必须具有高灵敏度和强选择性这两方面的性能。当然，也需要经过长时间的测量计数，以满足信号量的要求。

最后，值得指出的是：误差分为统计误差和系统误差，系统误差是无法通过积累信号量的方法来加以改善的，它必须通过对仪器的校准来加以解决。

《同步辐射中的振动散射能谱学：原理及其在生物化学研究中的应用》介绍了两种先进的同步辐射振动散射能谱学方法和它们在生物大分子研究中的应用。全书突出所涉各学科之间的交叉性和综合性，以帮助读者从原理上完整理解这些先进的谱学方法可以解决什么样的生物化学问题这样一个总体概念，并由此鼓励广泛的科研合作。取材上注重先进性、综合性和实用性，少理论、少公式、多图表，力求深入浅出、通俗易懂。

目录速览

第1章同步辐射：知微知彰的现代光源1

1.1同步辐射：第四代人造光源11.2同步辐射的主要特性31.3同步辐射的工作原理61.3.1同步辐射的基本原理61.3.2同步辐射装置的性能参数81.3.3同步辐射装置的工程参数.4同步辐射光源的基本构造.4.1同步辐射环.4.2插入件.4.3光束线.5同步辐射光源的历史和现状.5.1第一代同步辐射光源.5.2第二代同步辐射光源.5.3第三代同步辐射光源.6同步辐射的应用简介.6.1形貌学应用.6.2晶体学应用.6.3能谱学应用.6.4工艺学应用28参考资料29第2章X-射线能谱学：原理与测量.1能谱学基础：极简量子力学一览.1.1量子力学的发展简史.1.2薛定谔方程和一维势阱.1.3氢原子和类氢离子.1.4量子数和电子云.1.5量子系统的微扰.2X-射线能谱学的简介.2.1X-射线与原子的相互作用.2.2跃迁的量子力学解释.2.3硬X-射线吸收能谱学.2.4软X-射线吸收能谱学.2.5X-射线荧光能谱学.2.6其他类型的X-射线能谱学.3X-射线的基本探测方法.3.1透射测量.3.2间接测量.4探测微弱信号：大海捞针的艺术.4.1选择性：大海捞针的关键.4.2统计性：信号量的重要性.4.3信噪比：鉴定信号的真伪.5X-射线的荧光探测方法.5.1从能量上进行分辨的测量.5.2X-荧光探测器简介.5.3从时间上进行分辨的测量.6X-射线探测的核电子学.6.1能谱信号的分辨与分离.6.2整形放大.6.3滤波.6.4能量甄别.6.5时间甄别.6.6模数转换和数字信号处理器58参考资料59第3章X-射线振动散射能谱学.1X-射线散射能谱学的基本概念.1.1理解X-射线的散射过程.1.2非共振的非弹性散射.1.3共振型的非弹性散射.1.4测量X-射线散射：分光能谱仪.2测量振动：从中子散射说起.2.1中子的非弹性散射谱学.2.2中子散射的局限性.3X-射线振动散射能谱学的起源.3.1振动的能量和X-射线的能量.3.2X-射线振动散射能谱学的建立.3.3X-射线振动散射能谱学的名称.3.4X-射线振动散射能谱学的优势.4X-射线振动散射能谱学的原理.4.1X-射线非弹性散射的散射截面.4.2一维原子链的晶格振动问题.4.3声学波和光学波.4.4传播中的横波和纵波.5X-射线振动散射能谱学实验.5.1IXS实验对于光源的要求.5.2IXS实验对于探测系统的要求.5.3样品的测量环境.6X-射线振动散射谱图的分析.6.1从原始数据求取纯的IXS散射谱.6.2从晶格振动原理解读IXS散射谱93参考资料95第4章核共振振动散射能谱学.1核散射：从穆斯堡尔谱学说起.1.1X-射线的核散射和电子散射.1.2穆斯堡尔谱学原理.1.3穆斯堡尔谱学实验.2核共振振动散射能谱学的建立.2.1核共振振动能谱学的起源.2.2核共振振动能谱学的名称.2.3核共振振动能谱学的现状.3核共振振动散射能谱学的原理.3.1核共振散射的散射强度.3.2振动的核散射和选律.3.3核共振振动散射能谱学的优越性.4核共振振动散射能谱学的实验.4.1核振散射实验对单色器的要求.4.2同步辐射脉冲的时间结构.4.3核振散射实验对探测系统的要求.4.4测量核振散射的核电子学.4.5样品的测量环境.4.6核振谱学的测量流程.5几条核共振振动散射谱学的束线.5.1美国APS的03ID束线.5.2日本SPring-8的BL09XU束线.5.3日本SPring-8的BL19LXU束线.5.4其他的核振散射束线4.6核共振振动散射能谱的分析.6.1求取能态密度函数PVDOS.6.2用简正模态分析进行拟合计算.6.3用密度泛函理论进行拟合计算参考资料第5章研究的样品：生物化学基础知识.1生物分子的组分和结构.1.1氨基酸.1.2肽.1.3蛋白质.1.4核酸.2酶和酶的催化动力学原理.2.1酶：具有催化功能的蛋白质.2.2酶的催化动力学.2.3酶的催化机理5.2.4酶的应用和提纯.3含金属的酶和生物金属中心.4配位化合物和配位化学.4.1对生物金属中心的化学模拟.4.2配位化合物的概述.4.3配位化合物的构型.4.4配位化合物的理论.5金属酶的现代谱学研究.5.1实验室谱学的运用和研究.5.2同步辐射谱学的运用和研究参考资料第6章研究的问题：分子的振动和结构.1双原子分子：最简单的振子6.1.1谐振子模型6.1.2选律.1.3非谐振修正.2多原子分子：由简到繁.2.1简正振动.2.2选律.2.3杂化轨道和特征谱线.3金属–配体的振动谱学.3.1金属–配体的振动能量范围.3.2金属–配体的全部振动模态.4振动谱学的实验测量方法.4.1红外吸收光谱学的测量.4.2测量远红外谱学的困难.4.3拉曼散射谱学的介绍.4.4拉曼散射谱学的测量.4.5激光光致荧光光谱学.4.6选用核振散射能谱学参考资料第7章核振散射：对简单铁蛋白的研究.1分析最简单的铁配合物.2对玉红氧还蛋白的研究.2.1什么是玉红氧还蛋白？.2.2核振散射能谱图的概述.2.3对比拉曼散射光谱.2.4拟合氧化态的核振谱图.2.5拟合还原态的核振谱图.2.6对力常数的一些讨论.3晶体与溶液的核振散射谱图.4对铁硫蛋白的核振散射研究.4.1什么是铁硫蛋白？.4.2对Fe2S2簇的研究.4.3对Fe4S4簇的研究.4.4对Fe3S4簇的研究.5对肌红蛋白的核振散射研究2.6对单铁氢酶的核振散射研究.6.1什么是单铁氢酶？.6.2单铁氢酶谱图的初探7.6.3模型配合物的研究.6.4单铁氢酶谱图的理论拟合.6.5不同酸碱度对核振谱图的影响参考资料第8章核振散射：对固氮酶的探索.1有关固氮酶的基本概念.2固氮酶的结构和催化机理.2.1铁钼辅基的结构解析.2.2铁钼辅基的络合方式.2.3铁钼辅基中的高柠檬酸.2.4固氮酶的催化过程.3核振散射对固氮酶的初探.3.1对固氮酶铁蛋白的研究.3.2对P簇的研究.3.3对M簇的研究.3.4对M簇中心元素的推测.4核振散射对固氮酶+CO的研究.4.1Fe—CO振动区的谱学特征.4.2铁钼辅基呼吸模态的变化.4.3理论拟合和多谱学的综合运用.5核振散射对固氮酶前驱体的研究.5.1固氮酶前驱体简介.5.2前驱体VK簇的结构问题.5.3核振散射对前驱体的研究.6固氮酶活性中心的化学模拟.6.1对铁钼辅基的结构模拟.6.2高柠檬酸的金属配合物.6.3含氮、氢的金属配合物.6.4同步辐射对模型分子的研究参考资料第9章核振散射：对氢酶的探索.1有关氢酶的基础知识.1.1什么是氢酶？.1.2氢酶的分类.1.3研究氢酶的意义.2氢酶活性中心和催化机理.2.1镍铁氢酶的中心结构.2.2镍铁氢酶的催化机理.2.3铁铁氢酶的中心结构.2.4铁铁氢酶的催化机理.2.5氢酶中心的化学模拟.2.6氢酶的同步辐射能谱学9.3铁硫簇的核振散射能谱.3.1对DvMF氢酶的研究.3.2对SH氢酶的研究.4镍铁中心的核振散射能谱.4.1Ni—A态.4.2Ni—R态.4.3Ni—L态：Ni—Fe金属键.4.4Ni—C态.5铁铁中心的核振散射能谱.5.1对CpI氢酶的研究.5.2对CrI氢酶的研究9.6Fe—CO核振散射强度的对比参考资料第10章核振散射：对氢酶中Fe—H结构的探索.1探索Fe—H结构的意义和难度.1.1探索Fe—H结构的意义和现状.1.2探索Fe—H结构的难度.1.3Ni—R氢酶中的Fe—H结构：一个真实的例子10.2配位化合物中的Fe—H键30.2.1[FeH6]430.2.2[HFeCO].2.3镍铁氢酶模型30.2.4铁铁氢酶模型30.3氢酶中Fe—H键的可探测性30.3.1可测量的最低57Fe浓度30.3.2对Ni—H—Fe信号量的估计.3.3样品和束线条件的决定性改善30.3.4Ni—H—Fe谱峰的搜索区间30.4在氢酶中发现Ni—H—Fe30.4.1第一次发现Ni—H—Fe谱峰30.4.2进一步确认Ni—H—Fe谱峰30.4.3对Ni—H—Fe结构的间接推测.4.4确保氢酶样品处于Ni—R态.5理解镍铁氢酶中的Ni—H—Fe结构.6理解铁铁氢酶中的X—Fe—H结构.6.1反应中间态H+hydH的萃取.6.2ODT突变种的Fe—H结构.6.3多种铁铁氢酶的Fe—H结构比较参考资料第11章展望：新应用、新谱学、新光源.1X-射线振动散射谱学的应用和展望.1.1IXS谱学对声学波的研究.1.2IXS谱学对光学波的研究.1.3IXS谱学和其他谱学的对比.2核振散射谱学的展望.2.1进一步提高现有的信噪比.2.2核振散射对其他同位素的研究.2.3核振散射对非穆斯堡尔核的测量.3其他类型的核散射谱学简介.3.1时间域的核前向散射谱学.3.2能量域的核前向散射谱学.3.3扰动角关联谱学.3.4核灯塔效应和核探测技术.4下一代光源的展望：衍射极限环11.4.1自由电子激光装置.4.2衍射极限环.4.3同步辐射环带来的机会和挑战.4.4全书结语参考资料

（本文编辑：王芳）

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